鸭呼肠孤病毒在BHK-21细胞的繁殖与培养特性的研究
发表日期：2020-11-19
何信群 刘哲君、徐光菊、杨静、李小意
关键词：鸭呼肠孤病毒；BHK-21细胞
1、材料
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BHK-21细胞 已贴壁致密的细胞。
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培养液 含1%胎牛血清的DMEM溶液。
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毒株 鸭呼肠孤病毒NDRV-SK16-XB株。
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细胞培养器皿 中方瓶、175cm扁瓶、细胞工厂（CORNING）
2、试验方法
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为了解新型鸭呼肠孤病毒NDRV-SK16-XB株细胞毒在BHK-21细胞中的繁殖与培养特性的规律，我们通过测定不同时间点的细胞病毒液的含量，然后依据实验结果，绘制出病毒增殖的一步生长曲线。具体步骤如下：
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细胞细胞传代 将长满单层细胞，弃去培养液，用0.25%胰酶清洗细胞表面后弃去，再加入0.25%胰酶覆盖细胞单层，37℃消化5~20分钟（每5分钟镜下观察细胞消化情况）使细胞脱壁，倒出胰酶，加入含8%血清的DMEM高糖培养基冲洗细胞使细胞完全脱壁，按1:3~1:5传代比例补足培养液，分装至合适的细胞培养方瓶，37℃、5%CO2培养，每日观察细胞生长情况。48~72小时后即可长满单层。
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细胞工厂扩大培养 8个底面积175cm2方瓶按细胞传代方法传入1个细胞工厂（美国CORNING，10层），补足含8%血清的DMEM高糖培养基，混匀后37℃、5%CO2培养，每日观察细胞生长情况（24～48小时可长满）。细胞密度为4×106～5×106 个细胞/m2。
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细胞接毒 按照1-3%接毒量，将NDRV-SK16-XB株细胞种毒接种生长良好的单层BHK-21细胞。
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不同时间点细胞病毒液的收获 按照以下时间点，在接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h和120h共8个时间点收集病毒液，反复冻融三次，-80℃保存备用。
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测定不同时间点细胞毒TCID50 在96孔板单层BHK-21细胞系上测定每个时间点的细胞病毒液的TCID50 。
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对测定的结果进行分析，绘制一步生长曲线。
3、试验结果
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细胞观察情况在扁瓶和细胞工厂中观察细胞，均可见细胞透明，梭形，均一。细胞工厂是良好的细胞培养器皿，对贴壁细胞培养有许多优势。产量大，用于接毒，收获收获量大，均一，稳定。大扁瓶仅175cm2。见图1、图2。
图1 BHK细胞不同生长期的小方瓶及中扁瓶、大扁瓶的外观图
图2 洁净百级的细胞工厂接毒、培养和观察
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不同时间点细胞病毒液的收获液测定结果细胞工厂37℃、5%CO2培养48小时，镜下可见BHK健康细胞，透明，梭形，均一。细胞密度为4×106～5×106 个细胞/m2（图3）。
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细胞接毒后12小时、48小时细胞病变情况，镜下可见细胞园缩、变形、脱落（图4）。
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通过测定不同时间点的细胞病毒液的含量，试验数据见生长曲线见图5，从该次试验数据可得知，0~12h为病毒的潜伏期并没有出现细胞病变，12h后病毒开始增殖，12~36h之间病毒进入快速增殖期，可以观察到明显的细胞病变，48h病毒滴度即达到最高，TCID50 为10-7.8/0.1mL，细胞病变最明显。随后病毒含量随着细胞的崩解而降低。
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试验得到的这一规律与该病毒在接种BHK-21细胞上所观察到的细胞病变过程基本保持一致。不同时间点病毒感染细胞的病变情况见图6。
图3 细胞工厂37℃、5%CO2培养48小时，镜下可见BHK健康细胞，透明，梭形，均一。细胞密度为4×106～5×106 个细胞/m2。
图4 细胞接毒后12小时、48小时细胞病变情况，镜下可见细胞园缩、变形、脱落。
图5 NDRV-SK16-XB株在BHK-21细胞中的增殖规律
图6 不同时间点病毒感染细胞的病变情况
4、结论
本试验研究了新型鸭呼肠孤病毒NDRV-SK16-XB株细胞毒在BHK-21细胞中的繁殖与培养特性的规律，我们通过测定不同时间点的细胞病毒液的TCID50 ，可得知，鸭呼肠孤病毒NDRV-SK16-XB株细胞毒TCID50 为10-7.5/0.1ml，按1%接种于贴壁致密的细胞中，于37℃孵育1h后,加入含1%胎牛血清的DMEM培养液使病毒液在细胞瓶的终浓度为1%，置37℃培养箱培养，48h后病毒滴度即达到最高，TCID50 可达10-6.67/0.1mL，细胞病变最明显。
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